周辺特許情報

本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関し、以下の工程を含む；（1）多能性幹細胞を培養し、胚様体を形成する工程、（2） 前記胚様体を培養し、中胚葉を誘導する工程、（3）前記中胚葉誘導後の胚様体をエストラジオール、エストロン及びエストリオールからなる群より選択される一種以上の存在下で培養し、心筋細胞を誘導する工程、及び（4）工程（2）開始から４０日目までの間に前記心筋細胞誘導後の胚様体を解離する工程。

本発明は、多能性幹細胞から小腸上皮様細胞への分化誘導方法に関し、以下の工程を含む；（1）多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化誘導する工程、及び（2）前記分化誘導により得られた内胚葉細胞をBIO（6-Bromoindirubin-3'-oxime (GSK-3 Inhibitor IX)）及びDAPT（N-[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester (γ-secretase inhibitor)）を含む系で培養し、さらにALK5阻害物質、Wnt3a及びEGFを含む系で培養する工程。

本発明は、幹細胞（iPS細胞の場合を含む）から赤血球系細胞への分化誘導方法に関し、当該方法は特定の11段階からなる工程を含む。

本発明は、哺乳動物の多能性幹細胞培養物をWntシグナル伝達又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤のひとつ以上と接触させ、原始的網膜幹細胞を作製する方法に関する。さらに当該原始的網膜幹細胞から、光受容細胞を作製する方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含むことを特徴とする；(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤及びPKC活性化剤を含む培地中で培養する工程、並びに(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤及びEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。好ましい形態として、前記WNTシグナル阻害剤が、明細書中に特定される化合物又はその塩である。

本発明は、特定のイミダゾピリジンアミン化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、多能性幹細胞から神経細胞への分化を促進するための神経細胞分化促進剤に関する。

本発明は、ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊ゲル培地の上清を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、創傷治療剤、表皮細胞増殖促進剤、発毛剤、及び育毛剤等に関する。

本発明は、脂肪酸担持量が0.1～0.65mg/gに低減されたアルブミンを終濃度0.5～5mg/mlで含有する多能性幹細胞の培養用培地に関する。本培地を使用することにより、iPS細胞の未分化状態を維持したまま効率的に増殖させることができる。

本発明は、フィーダー細胞およびコンディショニング培養培地を含む接着培養条件で培養された多能性幹細胞から分化した細胞集団における未分化多能性幹細胞の存在を検出する（又は非存在を確認する）方法に関し、第１の胚性幹細胞マーカーを検出する第１の染色、及び第２の胚性幹細胞マーカーを検出する第２の染色を適用することを特徴とする。

本発明は、ヒト膵臓内分泌細胞の細胞集団を生成する方法であって、該方法は、(a)ヒト多能性幹細胞をアクチビンＡを追加した培地中で培養しヒト胚体内胚葉細胞へと分化させる工程、(b)前記ヒト胚体内胚葉細胞をPDX1及びNKX6.1を発現するヒト膵臓内胚葉細胞へと分化させる工程、及び(c）PDX1及びNKX6.1を発現するヒト膵臓内胚葉細胞を、ノギン、ALK5阻害剤II及び(2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-2, 4-ぺンタジエノイルアミノベンゾラクタムを追加した培地で培養することにより、NKX6.1及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現するヒト膵臓内分泌細胞を生成する工程を含むことを特徴とする。

本発明は、多能性幹細胞の分化誘導時及び／又は分化誘導後の細胞培養液の培養上清におけるmiR302/367クラスターのmiRNAを定量RT-PCR法により測定し、当該miRNA測定値に基づいて前記細胞培養液中の細胞の分化状態を評価する方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞から色素幹細胞を製造する方法に関し、以下の工程を含むことを特徴とする；(a) 多能性幹細胞を浮遊培養して胚様体を形成させる工程、(b) 工程(a)で得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程、及び(c) 工程(b)で得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程。

本発明は、NKX2.1を発現しPAX6を検出可能に発現しない霊長類内側神経節隆起前駆細胞が富化された細胞培養物を提供する方法に関し、当該方法はノックアウト血清代替物を含まず下記複数の因子を含む無血清培地中で霊長類多能性幹細胞処理することを特徴とする；(a)shh経路活性化因子、(b)SMAD阻害剤、(c)wnt経路阻害剤、及び(d)神経誘導サプリメント。

本発明は、ヒト自己再生性内胚葉前駆細胞を作製する方法に関し、(a)ヒト多能性幹細胞をアクチビンＡまたはノーダルを含む無血清培地中で培養する工程、(b)工程(a)の細胞を、アクチビンA、BMP4、VEGF、およびFGF2を含む無血清培地中で培養して胚体内胚葉細胞を作製する工程、(c)工程(b)の胚体内胚葉細胞を洗浄し、予め冷却した基底膜調製物を洗浄した細胞に添加する工程、及び(d)工程(c)で得られた細胞を、無血清培地中にBMP4、VEGF、FGF2、およびEGFを含む浮遊培養物(基底膜調製物を含む)中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞の増殖を選択的に促進する工程を含む。本発明はさらに、前記方法の後に一定の工程を行う単一ホルモン性膵島ベータ細胞を作製する方法に関する。

本発明は、薬剤スクリーニングに用いる心筋組織チップの製造方法に関し、表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆されたiPS細胞由来心筋細胞及び線維芽細胞を75:25～50:50の比率でマルチウェルプレートへ繰り返し播種し、当該細胞が５層以上積層された心筋三次元組織体を複数個形成することを特徴とする。

本発明は、神経細胞を含む構造物上でiPS細胞を培養することを含むiPS細胞から神経細胞系統への分化誘導方法に関し、構造物中の細胞と分化誘導された細胞が同じ神経細胞マーカーを少なくとも１つ発現することを特徴とする。発明者らは、再生を目指す組織・臓器の凍結切片上でiPS細胞を培養することにより目的とする細胞への分化誘導を高効率で達成できることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、SSEA1陰性の多能性幹細胞をフィーダー細胞不在下で少なくとも５継代、未分化状態で増殖・維持するための無血清および異種成分不含の培地に関し、bFGF、TGFβ3、 及び少なくとも約50μg/mlのアスコルビン酸を含むことを特徴とする。

本発明は、iPS細胞に由来する巨核球から血小板を作製する方法に関し、(a)CD41a及びCD42b発現陽性であるiPS細胞由来巨核球の非接着性培養物を提供する工程、(b)該巨核球を、造血拡大増殖培地、TPO、SCF、IL-6及びIL-9と接触させ、血小板放出能があり、かつ該血小板の少なくとも60％がCD41a及びCD42b発現陽性である前血小板を形成させる工程、並びに(c )該血小板を単離する工程を含む。

本発明は、Oct4、Klf4、Sox2及びcMycからなる遺伝子の導入によって作製されるiPS細胞の染色体安定性維持用組成物に関し、活性成分として、SB431542、PD0325901、チアゾビビン、及びL-アスコルビン酸を含むことを特徴とする。

本発明は、ヒトiPS細胞をヒト腎近位尿細管細胞(hPTC)様細胞に分化させる方法に関し、 (1)未分化ヒトiPS細胞を、増殖因子低減型マトリゲルマトリックスでコーティングした培養支持体に、BMP2及びBMP7を含まず、かつ約1-25μMのROCK阻害剤を含む腎上皮細胞培養培地中で、約12～24時間、約5000～10000の生細胞/cm2の密度で播種する工程、(2) 前期腎上皮細胞培養培地を、ROCK阻害剤を含まず、かつ約1～25ng/mlのBMP2及び約0.25～10ng/mlのBMP7を含む新鮮な腎上皮細胞培養培地と交換する工程、並びに(3) 工程(2)の細胞を、約37℃及び約2～10％CO2の環境下で、さらなる継代なしに、約8～10日間、BMP2及びBMP7を含む腎上皮細胞培養培地中で培養し、AQP1及びOAT3を発現し、かつOct3/4及びDNMT3Bをさらに発現するhPTC様細胞への分化を誘導する工程を含む。

本発明は、ヒト多能性幹細胞からヒト内皮コロニー形成細胞様細胞（ECFC様細胞）の単離集団を作製する方法に関し、以下の工程(a)-(c)を含むことを特徴とする；(a)多能性幹細胞を提供する工程、(b)多能性幹細胞の内皮分化を誘導する工程（すなわち、アクチビンA、BMP-4、VEGF、及びFGF-2を含む内皮分化培地で多能性幹細胞を約24時間培養し、その後、１又は２日ごとにBMP-4、FEGF、及びFGF-2を含む内皮分化培地で培地交換する工程）、及び(c) 工程(b)の細胞からCD31+NRP-1+でありコブルストーン形態を示すECFC様細胞を単離する工程。

本発明は、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する分化した多能性幹細胞の集団を含むインビトロ細胞培養物に関し、当該細胞集団の少なくとも10%がインスリン、PDX1、NKX6.1、及びMAFAを発現し、当該細胞集団はRSK阻害剤、DOT1L阻害剤、又はそれらの組み合わせを含む培地で処理することにより得られることを特徴とする。本発明はさらに、多能性細胞から誘導される細胞内でMAFA発現を誘導する方法に関し、多能性細胞をRSK阻害剤、DOT1L阻害剤、又はそれらの組み合わせを含む培地で処理し、より成熟表現型の膵内分泌細胞に分化させる工程を含むことを特徴とする。

本発明は、ヒトES細胞 及び/又はiPS細胞を以下の工程で培養することを特徴とするインスリン産生細胞の分化誘導方法に関する；(1)ヒトES細胞及び／又はiPS細胞を、(1-1)アクチビン受容体様キナーゼ－4,7の活性剤及びGSK3阻害剤を含む培地で培養し、さらに(1-2)アクチビン受容体様キナーゼ－4,7の活性剤を含む培地で培養する工程、(2)工程(1)で得られた細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤及びFGFを含む培地で培養する工程、(3)工程(2)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、及びBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、(4)工程(3)で得られた細胞を、TGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ－4,5,7阻害剤、BMPシグナル伝達阻害剤及びプロテインキナーゼＣ活性化因子を含む培地で培養する工程、及び(5)工程(4)で得られた細胞を、ニコチンアミド及びGLP-1受容体アゴニストを含む培地で培養する工程。

本発明は、iPS細胞又はES細胞の分化状態の判定方法に関し、分化誘導処理を施した又は未分化状態を維持する処理を施したiPS細胞又はES細胞のFOXB2 mRNAを検出し、下記(1)又は(2)の方法により判定を行うことを特徴とする；(1)分化誘導処理後又は未分化状態を維持する処理後７日目までにFOXB2 mRNAが検出された場合に、その細胞が分化した状態であると判定する；又は(2)(i)未分化状態であることを確認した対照のiPS細胞又はES細胞のFOXB2 mRNAを検出し、分化誘導処理後又は未分化状態を維持する処理後７日目までの被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が、対照のiPS細胞又はES細胞のFOXB2 mRNAの検出量より多い場合に、該iPS細胞又は該ES細胞は分化した状態であると判定する。

本発明は、第一モノマー（グリセロールジメタクリレート）と第二モノマー（ジアクリレートモノマー又はジメタクリレートモノマー）から形成されるコポリマーを含むポリマー表面上かつ合成培地中でヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞を培養する方法、さらには、当該細胞培養物に関する。本発明によれば、動物由来成分を完全に含まない系で当該細胞を培養することができる。

本発明は、ヒト神経堤細胞（ヒト多能性幹細胞由来の場合を含む）から自律神経系の細胞を作製する分化誘導方法に関し、(a)ヒト神経堤細胞をBMPシグナル活性剤、SHHシグナル阻害剤、及びWntシグナル阻害剤から成る化合物の組み合わせの存在下で培養を行う工程、並びに(b)工程(a)の後に当該ヒト神経堤細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル活性剤、CNTFシグナル活性剤、GDNFシグナル活性剤、NGFシグナル活性剤、NT-3シグナル活性剤、及びアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物の存在下で培養する工程を含むことを特徴とする。

本発明は、有効量の古典的Wnt／ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤を含みTGFβシグナル調節剤を含まない培養培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む、人工ヒト沿軸中胚葉前駆細胞を調製するex vivo方法に関し、当該古典的Wnt／ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤は、R-spondin3、R-spondin2、若しくはそれらの組合せであるR-spondinファミリーであるか、又はCHIR99021若しくはLiClであるGSK-3β阻害剤である。

本発明は、(1)霊長類多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、及び(2)工程(1)で形成された凝集体を、Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む、無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程を含む、網膜前駆細胞の製造方法に関する。

本発明は、ヒト多能性幹細胞から、サイトケラチン15及びCD49fを発現し生着可能なヒトケラチノサイト幹細胞を製造する方法に関し、(a)規定培地中で浮遊培養し、多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、(b) レチノイン酸およびBMP4を含有する開始培地中で浮遊培養し、開始凝集体の形成を促す工程、(c)コレラ毒素およびTGFβR1キナーゼ阻害剤を含有するケラチノサイト前駆体培地中で開始凝集体を培養し、ケラチノサイト前駆細胞を含む細胞集団の形成を促す工程、及び(d) コレラ毒素およびVEGFを含むケラチノサイト幹細胞成熟培地中でケラチノサイト前駆細胞を培養し、生着可能なケラチノサイト幹細胞を含む細胞集団の形成を促す工程を含む。

本発明は、インビトロで幹細胞（ヒトiPS細胞の場合を含む）のメラニン芽細胞への定方向性分化を誘導するための方法に関し、第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、第三シグナル伝達インヒビターおよびメラニン芽細胞の誘導を増強する分子を幹細胞を含む細胞培養物に添加することを含み、前記第一シグナル伝達インヒビターはTGFβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達を低下させ、前記第二シグナル伝達インヒビターはSMADシグナル伝達を低下させ、前記第三シグナル伝達インヒビターはWntシグナル伝達の活性化のためにGSK3βを低下させ、前記メラニン芽細胞の誘導を増強する分子がBMPおよびエンドセリン（EDN）を含む、方法。