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本発明は、ヒト多能性幹細胞の無血清培地に成長停止特異的タンパク質6（ Growth arrest-specific 6； GAS6）を添加することにより、 血清及びフィーダー細胞を用いることなくヒト多能性幹細胞の増殖を促進できることを見出したこと、すなわち、GAS6をヒト多能性幹細胞の増殖促進因子として同定したことによって完成され、「抗GAS6抗体又はGAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む、単離したGAS6の存在下で培養される多能性幹細胞の増殖抑制剤」に係る発明を権利範囲として成立した。

本発明は、多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞を製造する方法に関し、(a)多能性幹細胞を膵臓前腸前駆細胞に分化させる工程、及び(b)ALK5阻害剤IIと、トリヨードチロニンを補足した少なくとも１つの培地で空気−液体界面にて培養し、膵臓前腸前駆細胞を膵臓内分泌細胞に分化させる工程を含む。

本発明は、多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を製造する方法に関し、以下の工程を含む；(i) 多能性幹細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤から成る群より選択される試薬を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、(ii) 工程(i)で得られた細胞からCorinに結合する物質および/またはLrtm1に結合する物質を用いてCorinおよび／またはLrtm1陽性細胞を収集する工程、および(iii)工程（ii）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培養液中で浮遊培養する工程。

本発明は、多能性幹細胞の未分化状態の維持を判定する方法に関し、培地中の細胞外代謝物の変動値の経時的変化を評価する工程を含み、当該変動値は（i）L-乳酸の変動量に対するL-グルタミン酸の変動量の比、（ii）L-乳酸の変動量に対するL-アラニンの変動量の比、及び(iii) L-乳酸の変動量に対するアンモニアの変動量の比、からなる群から選択される少なくとも１つである方法。

本発明は、多能性幹細胞の未分化状態の維持を判定する方法に関し、培地中の細胞外代謝物の変動値の経時的変化を評価する工程を含み、当該変動値は（i）L-乳酸の変動量に対するL-グルタミン酸の変動量の比、（ii）L-乳酸の変動量に対するL-アラニンの変動量の比、及び(iii) L-乳酸の変動量に対するアンモニアの変動量の比、からなる群から選択される少なくとも１つである方法。

本発明は、多能性幹細胞のin vitro分化に由来する10³個〜10⁹個の生網膜色素上皮（RPE)細胞（該RPE細胞の平均メラニン含有量が8pg/細胞未満)及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。

本発明は、多能性幹細胞を誘導する方法において、M蛋白質、HN蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質に特定の変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターでありKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターを導入し、36.5℃未満で培養せずに、誘導効率を改善する方法に関し、当該ベクターに加えてさらに、M蛋白質、HN蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質に特定の変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターでありKLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターを導入することを特徴とする。

本発明は、多能性幹細胞の凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地中で、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF5からなる群から選択される１以上の物質の存在下で浮遊培養することを含む、内部にRx陽性及びChx10陽性である神経上皮様構造を有し、表層に前記神経上皮様構造と隣接してパン‐サイトケラチン陽性である角膜及び角膜の前駆組織、ならびにL-Maf陽性である水晶体及び水晶体の前駆組織からなる群より選ばれる少なくとも１つを有する細胞凝集塊の製造方法に関する。

本発明は、未分化状態で多能性幹細胞を培養し維持する方法に関し、0.5-1μMのPD0325901（MEK阻害剤）、1-2μMのBIO(GSK３阻害剤)、2μMのドルソモルフィン（AMPK及び／又はBMPシグナル伝達二重阻害剤）ならびに8-10ng/mlのLIFを含む培地で前記多能性幹細胞を培養する工程を含む。

本発明は、分化状態が未知の多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞の分化状態を評価する方法に関し、(i)指標物質として被検細胞の培養上清中のキヌレニン及び/又はシスタチオニンの存在量を測定するステップと、(ii)前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞の分化状態を評価するステップを有することを特徴とする。

本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団からインスリン産生細胞の生成効率を高める方法に関し、(i) CD56陽性かつCD13陰性の該細胞集団、 (ii) CD133陰性である該細胞集団、(iii) CD49ｃ低発現である該細胞集団、(iv) CD56陽性かつCD15低発現である該細胞集団、あるいは(v) CD56およびCD57が陽性である該細胞集団のひとつ以上を単離し、該細胞集団を、NEUROD、NGN3、PDX1およびNKX6.1の発現について濃縮する工程を含む。

本発明は、多能性幹細胞から血管内皮細胞を製造する方法に関し、以下の工程を含む；(i)多能性幹細胞を第一のマトリックスでコーティングされた培養器上にてBMPを含む培養液中で培養し中胚葉前駆細胞を製造する工程、(ii)工程(i)で得られた中胚葉前駆細胞を単細胞に解離させる工程、および(iii)工程(ii)で得られた細胞をラミニン-411、-511（またはそれらの断片）、マトリゲル、IV型コラーゲン、およびフィブロネクチンから成る群より選択される第二のマトリックスでコーティングされた培養器上にてVEGFを含む培養液中で培養する工程。

本発明は、ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を作製する方法に関し、(a)１以上の増殖因子を含有する培地を用いて造血前駆細胞（多能性幹細胞に由来する場合を含む）を培養してNK細胞の分化を誘導する工程、および(b)工程(a)で誘導されたNK細胞を無血清培地中で不活化人工抗原提示細胞（aAPC）と共培養する工程を含むことを特徴とする。

本発明は、ヒト体細胞をリプログラミングして、フィーダーフリー、異種フリーかつ組み込みフリーの人工多能性幹細胞（iPSC)を作製する方法に関し、該方法は（i）N末端MyoDトランス活性化ドメインに融合したOct4をコードする合成mRNAと（ii）Sox2, Klf4, cMyc, NanogおよびLin28をコードする合成mRNAを有効量含む組成物を、単離されたヒト細胞にトランスフェクトする工程を含み、該合成mRNAは、4：1比のARCAキャップアナログ：GTPを使用した転写反応によって作製され、NTPミックスはCTPおよびUTPがそれぞれ5m-CTPおよびプソイド-UTPで完全に置換されており、 該組成物はフィーダーフリーかつ異種フリーで１日１回の培地交換により該単離された体細胞に添加される方法。

本発明は、CD56およびPDGFRαを発現する原始線条様中胚葉細胞集団（特定の方法で多能性幹細胞集団から作製された場合を含む）から特定の方法で作製された関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織をそれぞれ含む軟骨細胞及び／又は軟骨の作製方法に関する。

本発明は、ラミニン511E8フラグメントがコーティングされた培養基材上でヒト多能性幹細胞を分化誘導因子の存在下で接着培養する工程を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法に関する。

本発明は、網膜色素上皮細胞の純化方法に関し、多能性幹細胞をラミニン511E8フラグメント上で網膜色素上皮細胞を含む細胞群に分化誘導する工程、さらに、得られた細胞群を回収し、当該細胞群のなかの網膜色素上皮細胞間の接着を解離し、得られた細胞群をフィルターを通過させて網膜色素上皮細胞群を得る工程を含む。

本発明は、視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含む多能性幹細胞由来の凝集体に関し、当該凝集体の表層に該頭部非神経外胚葉が存在し、その内側に該視床下部組織が存在し、前記頭部非神経外胚葉がシート状の連続上皮であることを特徴とする。本発明はさらに、当該凝集体を培養及び／又は単離・精製し、下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を含む医薬の製造方法に関する。

本発明は、医薬品中で使用するための網膜色素上皮(RPE)細胞を製造する方法に関し、(a)多能性幹細胞のin vitro分化から生成されたRPE細胞を付着条件下で培養し、敷石状形態を有する色素性RPE細胞の単層を形成する工程、(b)前記RPE細胞を少なくとも１代継代する工程、(c)継代後、前記RPE細胞が、細胞あたり5pg未満の平均メラニン含有量を有するとき、冷凍保存または製剤処方のためにRPE細胞を収穫する工程（収穫された細胞の少なくとも99％がベストロフィンおよび／またはPAX6ならびにZO-1について陽性）を含む。

本発明は、巨核球－赤血球前駆細胞（MEP)を作製する方法であって、多能性幹細胞をアリール炭化水素受容体(AHR)アゴニストの存在下でMEPに分化させることを含む。本発明はさらに、当該MEPを培養し赤血球を作製する方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞を胚体内胚葉(DE)系列細胞に分化させる方法に関し、(i)前記多能性幹細胞を(a)TGFβ/Nodal経路の１以上のアクチベーター、(b)Wnt経路の１以上のアクチベーター、および(c) PI3K/mTOR経路の１以上のインヒビターと接触させて、24時間以内に前記多能性幹細胞から原始線条前部(APS)系列細胞を産生させる工程、ならびに(ii)前記APS系列細胞を、(a')TGFβ/Nodal経路の１以上のアクチベーター、および(b')BMP経路の１以上のインヒビターと接触させて、48時間以内に前記APS系列細胞からDE系列細胞を産生する工程を含む。

本発明は網膜色素上皮細胞の製造方法に関し、(1)ヒト多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養し凝集体を形成させる工程、(2)工程(1)で形成された凝集体をRax遺伝子発現細胞が出現するまでソニック・ヘッジホッグシグナル作用物質を含まずBMPシグナル作用物質を含む培地中で浮遊培養し網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、および(3)工程(2)で得られた凝集体をソニック・ヘッジホッグシグナル作用物質及びＢＭＰシグナル作用物質を含まずWntシグナル作用物質を含む培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る工程を含む。

本発明は、多能性幹細胞（iPS細胞である場合を含む）の凝集塊をWnt阻害剤及びTGFβ阻害剤の存在下で浮遊培養することにより終脳マーカー陽性凝集塊を得ること、および該終脳マーカー陽性凝集塊を高酸素分圧条件下で更に浮遊培養することを含む、終脳あるいはその前駆組織を含む細胞凝集塊の製造方法に関する。本発明によれば、多能性幹細胞から選択的に終脳若しくはその部分組織（大脳皮質、大脳基底核、海馬、脈絡膜等）あるいはその前駆組織を誘導することができる。

本発明は、1-AzaKenpaullone ( GSK3β阻害剤）およびDYRK (dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase) 1Aおよび／またはDYRK1Bの阻害剤を含有する多能性幹細胞培養用培地に関する。当該培地の使用により、血清や分化抑制タンパクを使用せずに多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。

本発明は、(a) 網膜前駆細胞をIGF1受容体(IGF1R)活性剤及びWnt活性剤を含む培地で培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させる工程、および(b)該未成熟網膜神経節細胞をWnt活性剤を含まない工程(a)の培地中で培養する工程を含む、幹細胞から成熟網膜神経節細胞を製造する方法に関する。当該網膜前駆細胞は、(a')幹細胞（iPS細胞である場合を含む）をIGF1R活性剤、Wnt阻害剤及びBMP阻害剤を含む培地で培養し浮遊凝集体の形態の眼球領域前駆体に分化させる工程、および(b')当該眼球領域前駆体をFGF活性剤を添加した工程(a')の培地中で培養し網膜前駆細胞に分化させる工程により作製される場合を含む。

本発明は、哺乳動物人工多能性幹細胞前駆体を選択するための方法に関し、(i)参照細胞と比べて増加した発現レベルのERRα、ERRγ、またはそれらの両方から選択される内因性エストロゲン関連受容体(ERR)、(ii)参照細胞と比べて増加したレベルのPGC-1α、PGC-1β、および/またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ3（IDH3）、ならびに(iii)ERR発現細胞における、参照細胞と比べて増加した酸化的リン酸化活性および増加した解糖の一方または両方を選択指標として使用して、当該人工多能性幹細胞前駆体を選択する工程を含み、当該人工多能性幹細胞前駆体はOct4、Sox2、Klf4、およびcMycリプログラミングマーカーを発現し、かつ(a)参照細胞と比べて低下したレベルのSca1およびCD34の発現、または(b)参照細胞と比べて増加したレベルのNADH、α-ケトグルタル酸、細胞ATP、NADH/NAD+比、ミトコンドリアATP5G1、SDHB、IDH3およびNDUFA2、SOD2、NOX4、カタラーゼ、もしくはそれらの組み合わせから選択される分析物の発現のいずれか一方または両方を有する（該参照細胞は検出可能レベルのSca1およびCD34を発現するかまたはOct4、Sox2、Klf4、およびcMycのうちの1つもしくは複数を検出可能なレベルで発現しない細胞）。当該人工多能性幹細胞前駆体から高効率で人工多能性幹細胞（iPSC）を得ることができる。

本発明は、哺乳動物由来の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法に関し、（1）該多能性幹細胞の培養物中にカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む特定のアミノ酸配列の合成ペプチドを少なくとも１回供給すること、ならびに（2）該培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリンの発現量を調べ、該発現量に基づいて該多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別することを特徴とする。

本発明は、ヒト網膜前駆体をin vitroで作製するための方法に関し、(1)MEFフィーダー層からなる接着性培養系において、コロニー型単層を形成しているヒト多能性幹細胞を神経促進培地（トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む）中で接着培養する工程、および(2) 色素細胞および／または神経上皮様構造の出現まで少なくとも７日間、前記神経促進培地中で当該培養物を維持する工程を含む。

本発明は、哺乳類体細胞集団を約40～80μg/mlの水酸化アルミニウム及びリプログラミング因子のカクテルと接触させることを含む、哺乳類体細胞の核リプログラミング効率を高める方法に関する。

本発明は多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導させるための分化誘導剤に関し、当該誘導剤はアミロイド前駆体タンパク質ファミリーのいずれかのタンパク質のシグナルペプチドに由来するアミノ酸配列を有する合成ペプチドを有効成分として含み、当該合成ペプチドはＮ末端側またはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有することを特徴とする。