周辺特許情報

本発明は、ヒトフィーダー細胞層を用いて多能性幹細胞を膵内分泌細胞に分化させるための方法に関し、(a)多能性幹細胞を一定のタンパク質マーカー発現が陰性であり別の一定のタンパク質マーカー発現が陽性である膵臓由来間質細胞を含むヒトフィーダー細胞層上に蒔く工程、および（b）該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で処理する工程を含む。

本発明は、本質的に血清及び支持細胞層を含まない培養液中でのヒト多能性幹細胞の培養方法に関し、該培養液はアミノ酸類、ビタミン類、塩類、無機物類、トランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、インスリン若しくはインスリン代替物、約100 ng/mlのFGFを含み、該方法は少なくとも6回の継代に対して幹細胞が未分化状態で増殖することを支持し、培養液中の前記幹細胞の少なくとも90%がOct-4を発現することを特徴とする。

本発明は、生体の肝臓切離面に移植して肝組織を再生するための肝細胞を含む製剤に関し、該肝細胞はｉＰＳ細胞由来の肝芽細胞である場合を含む。

本発明は、霊長類の体細胞を再プログラムして多能性幹細胞を得る方法に関し、以下の工程（１）および（２）を含む；（１）ＳＶ４０Ｔ抗原およびヒトＯＣＴ－４、ヒトＳＯＸ２、ヒトＬＩＮ２８、ヒトＮＡＮＯＧ、ヒトｃ－ＭｙｃおよびヒトＫＬＦ４からなる群から選択される因子をコードする複数の非ウイルスエピソームベクターを霊長類体細胞に導入する工程であって、該非ウイルスエピソームベクターがヒトＯＣＴ－４及びヒトＳＯＸ２を単一のベクター内に含む工程、  および（２）前記細胞を培養して再プログラムされた多能性幹細胞を得る工程。

本発明は、 継代時に酵素処理を行うことなく単一細胞にまで分散させることができる多能性幹細胞の維持増幅培養方法、ならびに該方法で使用される分子量30-40kDaのゼラチンからなる架橋処理されたナノファイバーを含む多能性幹細胞の維持増幅培養用基材に関する。

本発明は、一定の環状デプシペプチドを心筋前駆細胞（side population細胞を含む生体内心筋前駆細胞、あるいは多能性幹細胞から誘導されたFlk1 (KDR)陽性の心筋前駆細胞）へ添加する工程を含む心筋細胞の製造方法に関する。

本発明は、心筋細胞を含有する細胞集団よりVCAM1陽性を指標として心筋細胞を抽出する工程を含む心筋細胞の製造方法に関する。該方法はさらに、PDGFRβ陰性を指標として、あるいはN-カドヘリン陽性を指標として心筋細胞を抽出する工程を含んでも良い。

本発明は、心臓組織生成に関与する幹細胞由来中間表現型細胞および製薬学的に許容される賦形剤を含む保存溶液からなり、凍結保存される医薬組成物に関する。前記中間表現型細胞は、ＭＥＦ２Ｃと、さらにＮｋｘ２．５、Ｔｂｘ５、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｍｅｓｐ１、ＦＯＧ１、ＦＯＧ２およびＦｌｋ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが非心臓形成細胞参照と比して少なくとも２倍増加し、Ｎｋｘ２．５またはＭＥＦ２Ｃが該細胞の核に移行し、検出可能レベルのＭＹＨ７発現を有さない。

本発明は、ヒト多能性幹細胞をレチノイン酸、BMP-4およびエナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で培養する工程を含む歯原性上皮細胞の製造方法、ならびにヒト多能性幹細胞をエナメルマトリックスタンパク質、神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で培養する工程を含む歯原性間葉細胞の製造方法に関する。

本発明は、インスリン産生細胞の形成に使用するための膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している濃縮された細胞集団に関するものであり、該濃縮された細胞集団は下記の工程(i)-(iii)により得られる； (i)多能性幹細胞集団を培養し、胚体内胚葉系、初期腸管系、膵内胚葉系、および膵内分泌系にそれぞれ特徴的なマーカーを発現している細胞集団へ段階的に分化させる工程、(ii)工程(i)の最終段階で得られた膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を単離、濃縮する工程、並びに(iii) 工程(ii)で得られた濃縮された細胞集団を哺乳動物に移植し、該哺乳動物においてインスリン産生細胞を形成させる工程。

本発明は、多能性幹細胞を維持するためのシステムに関し、該システムは0.5ng/ml～3.5ng/mlのbFGFを含む細胞培養培地および該幹細胞の支持体としてラミニン-521（ラミニン-511を欠く）を含む基質を含むことを特徴とする。

本発明は、多能性幹細胞のフォワードプログラミングにより造血前駆細胞を提供する方法に関し、ｉ）ＥＲＧおよびＧＦＩ１を含むか、または、ｉｉ）ＥＲＧおよびＧＡＴＡ２を含む２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させる条件下で、該多能性幹細胞を培養して造血前駆細胞を提供する工程を含む。

本発明は、幹細胞を分化誘導して得られた網膜色素上皮細胞で構成される細胞シートの製造方法に関し、（1）線維化されたブタ腱由来コラーゲンゲル上に該網膜色素上皮細胞を播種、培養し、細胞シートを形成させる工程、および（2）線維化されたブタ腱由来コラーゲンゲルをコラゲナーゼで分解し、該細胞シートを剥離する工程を含む。

本発明は、多能性幹細胞由来の網膜組織であって網膜層を構成する複数種類の細胞が層状で立体的に配列した構造体の凍結保存方法に関し、(1)凍結保護物質が(a) DMSOおよびエチレングリコール、または（b）DMSO、エチレングリコールおよびスクロースからなる細胞保護溶液を該網膜組織の該構造体に接触させる工程、(2)工程(1)で細胞保護溶液と接触させた該網膜組織を凍結保存液に保持する工程、(3)工程(2)で凍結保存液に保持された該網膜組織を冷却剤存在下にて凍結保存する工程を含む。好ましい形態として、工程(3)が１０℃/分以上の温度低下速度で凍結保存する工程であり、該凍結保存液が、DMSO、アセトアミドおよびプロピレングリコールを含む。

本発明は、ヒト胚性幹細胞またはiPS細胞に由来する血管芽細胞からナチュラルキラー細胞を生成する方法に関し、(i) 該血管芽細胞をメチルセルロース、並びに一定のサイトカインおよびFLT-3リガンドを含む第１のサイトカイン混合物上で培養する工程、(ii)工程(i)で培養した細胞を回収する工程、および(iii)工程（ｉｉ）で回収した細胞を、ヒト血清、並びに一定のサイトカインおよびFLT-3リガンドを含む第２のサイトカイン混合物を含む培地中で培養する工程を含む。本発明はまた、ヒト胚性幹細胞またはiPS細胞に由来する血管芽細胞から樹状細胞を生成する方法に関し、該血管芽細胞をヒト血清、並びに一定のサイトカインおよびFLT-3リガンドを含む培地中で培養する工程を含む。

本発明は、哺乳動物非多能性細胞からiPS細胞を作製する方法に関し、(a) i) Octポリペプチド、Klfポリペプチド、およびSoxポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む1つ以上の発現カセット、またはii) 外因性Octポリペプチド、外因性Soxポリペプチド、および外因性Klfポリペプチドを該非多能性細胞に導入する工程、ならびに(b)該非多能性細胞と、GSK3インヒビター、MEKインヒビター、およびTGFβ受容体/ALK5インヒビターを接触させる工程を含む。

本発明は、造血前駆細胞からヒトiPS細胞を作製するための方法に関し、ａ）造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団を提供し、ｂ）該造血前駆細胞の増殖を促進する条件下でその集団を培養し、 ｃ）iPS再プログラミング因子を発現する１以上の発現カセット（1以上のポリシストロニックなカセットを含む）を含む１以上の染色体外で複製するエピソーム性ベクターをその増殖造血前駆細胞に導入し、 ｄ）フィーダー非依存性培養においてその増殖造血前駆細胞を培養し、それによりその造血前駆細胞からヒトiPS細胞を作製させ、ｅ）iPS細胞について選択する段階を含む。

本発明は、網膜色素上皮細胞の製造方法に関し、下記（１）～（４）の工程を含む；（１）多能性幹細胞をWntシグナル経路阻害物質及び血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養し凝集体を形成させる第一工程、（２）第一工程で形成された凝集体を基底膜標品及び血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、（３）第二工程で培養された凝集体を血清培地中で浮遊培養する第三工程、および（４）第三工程で培養された凝集体をＧＳＫ３β阻害剤を含む血清培地（但し、前記血清培地とは、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物を含まない）中で浮遊培養する第四工程。

本発明は、網膜組織の製造方法に関し、下記（１）～（３）の工程を含む：（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質及び血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養し凝集体を形成させる第一工程、（２）第一工程で形成された凝集体を基底膜標品及び血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、および（３）第二工程で培養された凝集体を血清培地中で浮遊培養し網膜前駆細胞を誘導する第三工程。

本発明は、眼杯様構造体の製造方法に関し、下記（１）～（４）の工程を含む；（１）多能性幹細胞をWntシグナル経路阻害物質および血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養し凝集体を形成させる第一工程、（２）第一工程で形成された凝集体を基底膜標品および血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、（３）第二工程で培養された凝集体を血清培地中で浮遊培養する第三工程、および（４）第三工程で培養された凝集体をソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とGSK３β阻害剤とを含む血清培地中で浮遊培養する第四工程。

本発明は、分化能を向上させたヒト分化多能性幹細胞の製造方法に関し、（ｉ）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換されたＴＥＴ１タンパク質、および（ii）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目のアミノ酸残基間に１～５０個のアミノ酸が挿入されたＴＥＴ１タンパク質からなる群より選択され、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上した変異型ＴＥＴ１タンパク質を、ヒト分化多能性幹細胞に導入する工程を含む。

本発明は、多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法に関し、工程(A)を含む方法により多能性幹細胞から細胞凝集物を形成し、工程(B)を含む方法により該細胞凝集物から褐色脂肪細胞を得ることを特徴とする； (A)多能性幹細胞を、無血清環境において、BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2の組み合わせから成る造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い細胞凝集物を作製する工程； (B)該細胞凝集物を、BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2の組み合わせから成る造血性サイトカインの存在下で接着培養して褐色脂肪細胞を作製する工程。

本発明は、多能性幹細胞を効率よく安定して維持増殖する方法に関し、以下の工程(i)および(ii)を繰り返すことを含む；(i) 多能性幹細胞を細胞塊の平均直径が約200-約300μmとなるまで浮遊培養する工程、および(ii)工程(i)により得られた細胞塊を平均直径が約80-約120μmである均一な細胞塊に分割する工程。特に工程(ii)における分割が、細胞塊をメッシュに通すことにより行われることを特徴とする。

本発明は、改善された効率でiPS細胞を生成する方法に関し、(a)（ｉ）転写制御エレメント、（ｉｉ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１ヌクレオチド配列（第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子またはレポーターをコードする）、（ｉｉｉ）第１ヌクレオチド配列の３’に位置するＩＲＥＳ、および（ｉｖ）再プログラム因子またはレポーターをコードしＩＲＥＳの翻訳調節下であるように第２ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって(1)第１ヌクレオチド配列が再プログラム因子をコードする場合は第２ヌクレオチド配列は他の再プログラム因子またはレポーターをコードし、(2)第１ヌクレオチド配列がレポーターをコードする場合は第２ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードする発現カセット、を各ベクターが含む１つまたは複数のリプログラミングベクターを得る工程、ならびに(b)前記リプログラミングベクターを体細胞に導入してｉＰＳ細胞集団を提供する工程を含む。

本発明は、非多能性哺乳動物細胞を効率よく多能性幹細胞へ誘導する方法に関し、細胞が多能性幹細胞になるよう誘導するのに十分な条件の下で、前記非多能性細胞を3'-ホスホイノシチド依存性キナーゼ-1（PDK1）活性化剤と接触させる工程を含む。

本発明はヒトまたは他の哺乳類の体細胞をリプログラミングするための方法に関し、(a)前記体細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣをコードする修飾されたｍＲＮＡ分子を含む精製されたＲＮＡ調製物を導入する工程（前記修飾されたｍＲＮＡ分子は修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりにプソイドウリジン（Ψ）または１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）を含み、前記のＲＮＡ調製物はＲＮＡ夾雑物分子および二本鎖ＲＮＡ夾雑物分子を除去する工程により精製される）、および(b)複数日において前記の精製されたＲＮＡ調整物の導入を反復し、当該細胞を培養することによりｉＰＳ細胞へリプログラミングする工程を含む。

本発明は、細胞周期調節性転写因子ＤＰ－１のＣ末端領域のアミノ酸配列ＥＤＤＥＥからなり任意のタンパク質に融合し任意のタンパク質の分解を阻害するためのペプチドモチーフ、ならびに該ペプチドと融合した融合タンパク質に関する。好ましい形態のひとつとして、該融合タンパク質は、Ｓｏｘ２のＣ末端、Ｏｃｔ４のＮ末端、およびＫｌｆ４のＮ末端に該ペプチドモチーフが融合したアミノ酸配列の何れからなる融合タンパク質である。

本発明は、ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能をすべて欠損し、かつ、Ｌ遺伝子の持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycとが同一のゲノム上に存在することを特徴とする初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを、末梢血由来単球に感染させ、該細胞の初期化を行い、次いで該細胞から初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターをsiRNAおよび／またはマイクロRNAにより除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法に関する。

本発明は、肝細胞プログラミング因子遺伝子の１つ以上を含む少なくとも１つの外因性発現カセットを含む幹細胞のフォワードプログラミングにより肝細胞を産生する方法に関し、該方法は(A) ＦＯＸＡ２、(B) ＨＮＦ１Ａ、ならびに(C) ＨＨＥＸおよびＧＡＴＡ４からなる群より選択される1以上の遺伝子発現レベルを人工的に増加させる条件下において該幹細胞を培養する工程を含む。

本発明は、Activin Aを含有する溶液中で抑制性神経前駆細胞を培養し当該細胞を２から４倍に増殖させることを特徴とするES細胞またはiPS細胞から分化させた抑制性神経前駆細胞の増殖方法、ならびに該培養条件下で増殖した神経細胞の集団からActivin A受容体Acvr1のみを発現している細胞を単離することを特徴とする抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞の分離方法に関する。