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本発明は、多能性幹細胞を効率よく安定して維持増殖する方法に関し、以下の工程(i)および(ii)を繰り返すことを含む；(i) 多能性幹細胞を細胞塊の平均直径が約200-約300μmとなるまで浮遊培養する工程、および(ii)工程(i)により得られた細胞塊を平均直径が約80-約120μmである均一な細胞塊に分割する工程。特に工程(ii)における分割が、細胞塊をメッシュに通すことにより行われることを特徴とする。