周辺特許情報

本発明は、心筋細胞前駆細胞または心筋細胞に分化誘導されたヒトES細胞またはiPS細胞の集団から、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞集団を濃縮する方法に関し、細胞表面抗原であるSIRPA（CD172a)を発現している細胞を該細胞集団から単離する工程を含む。

本発明は、基質上で幹細胞由来網膜色素上皮細胞を凍結保存する方法に関し、該方法は、該細胞が播種されたパリレン膜からなる基質を、約７℃/分～約17℃/分の降温速度で温度低下フェーズに曝す工程、約-100℃～約-60℃の第１中間温度に6～48時間、移す工程、および液体窒素温度で維持する工程を含む。

本発明は、100μg/dl/24h以上のアンモニア代謝機能を有しかつ網状構造体を構成可能な人工肝細胞に関し、該人工肝細胞がiPS細胞から誘導される場合を含む。

本発明は、ヒトビトロネクチン又はヒトビトロネクチンの所定の部分アミノ酸配列を含むポリペプチドを被覆した培養表面上に多能性幹細胞を播種し、アスコルビン酸誘導体の含有量が1.5mmol/L(mM)以上である培地を用いて培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法に関する。

本発明は、被検生細胞（未分化幹細胞又は分化誘導処理された幹細胞を用いる場合を含む）に、BC2LCNレクチンのアミノ酸配列（又は該配列と90％以上の類似性を示すアミノ酸配列）を含みかつFucα1-2Galβ1-3GlcNAc及び／又はFucα1-2Galβ1-3GalNAcの糖鎖構造を認識するタンパク質からなるプローブを接触させる工程を含む細胞分化判定方法に関する。

本発明は、実質的に、多能性幹細胞から誘導された間葉系幹細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される移植可能な人工組織に関し、前記人工組織はαMEMにｂFGFを加えた条件またはDMEMの条件下で自己収縮を行うことによって生産されることを特徴とする。

本発明は、多能性幹細胞から分化した細胞集団における未分化多能性幹細胞の存在を検出する方法に関し、フィーダー細胞を含み未分化多能性幹細胞の増殖・維持に適した接着条件下で培養された分化細胞の調製物に、第1の胚性幹細胞マーカーであるアルカリホスファターゼを第1の光条件の下で検出可能な第1の染色、および第2の胚性幹細胞マーカーであるOct-4を第2の光条件の下で検出可能な第2の染色を該調製物に適用する工程を含む。

本発明は、ヒト神経細胞について富化された細胞集団を提供するための方法に関し、(a)ヒト多能性幹細胞の集団をTGFβおよびｂFGFを含む培地内で維持する工程、(b)無血清培養培地内で、支持細胞の不在下で凝集体形成前の5～3日間、ヒト多能性幹細胞集団を付着性培養において予備刺激する工程、(c)工程(b)の細胞から凝集体を形成する工程、(d)前記凝集体をさらに分化させて少なくとも85％のヒト神経細胞を含む細胞集団を提供する工程を含む。

本発明は、１種以上の非多能性哺乳動物細胞、ALK5阻害剤、MEK阻害剤、およびROCK阻害剤を含む混合物に関する。本発明はさらに、前記ROCK阻害剤が一定構造式で表される化合物である場合に、非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞へ誘導するin vitroまたはex vivoの方法に関する。

本発明は、ヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）をCD34+前駆細胞に分化させる方法に関し、以下の工程 (a)および(b)を含む； (a)ROCKインヒビターまたはミオシンＩＩインヒビターを含む培養培地中で多能性幹細胞を分散させる工程および前記分散させた細胞を10,000～50,000幹細胞/cm2培養面の密度で培養培地に播種する工程を含む、フィーダー細胞を含まない培養培地で多能性幹細胞を培養する工程、および(b)前記分散させた細胞を、胚様体を経ずに、5.5%未満の低酸素状態でBMP-4、VEGFおよびｂFGFからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む分化培地中で分化させ、CD34+前駆細胞を得る工程。

本発明は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質αをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターで多能性幹細胞をトランスフェクションすることを含む、肝細胞系譜細胞の製造方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞を特定の臓器・組織の細胞に分化誘導する培地に不死化細胞の培養上清を添加して培養し、前記の特定の臓器・組織の特性を有するがん幹細胞を作製し、前記がん幹細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記がん幹細胞と同じ特性を有する特定の臓器・組織にがんを作製することによるがんの非ヒトモデル動物に関する。

本発明は、層流条件下で培養することによるヒト多能性細胞を単一分散させて培養する方法に関する。

本発明は、抗原特異性を有するヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞をCD4/CD8ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、その後、Ｔ細胞受容体を刺激する物質を添加する工程と、前記の刺激を与えたCD4/CD8ダブルネガティブ細胞を、IL-7および/またはIL-15存在下でシングルポジティブＴ細胞に分化させる工程を含む、抗原特異性を有するヒトシングルポジティブＴ細胞の製造方法に関する。

本発明は(a)小胞性層状形態を有し、少なくとも90%の細胞がChx-10陽性ヒト網膜前駆細胞であるひとつ以上のニューロスフェア、及び(b)ヒト神経上皮系細胞の生存能力を維持するために必要な培地を含む、ヒト神経上皮系細胞の培養物に関し、 前記Chx-10陽性ヒト網膜前駆細胞が神経網膜細胞または網膜色素上皮細胞に分化することができる場合を含む。

本発明は、アクチビンA及びWntリガンドを含みグルコース濃度が10.5mMを超えない培地中で、多能性幹細胞集団を分化させる工程を含む細胞集団のうち80%超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を生成する方法に関する。

本発明は、一定の配列で示されるヒトビトロネクチンのアミノ酸配列のうち１番目～５５番目のアミノ酸配列、２７０番目～２７７番目であって但し２７４番目のシステイン残基がセリン残基に置換されているアミノ酸配列、および２９５番目～３７３番目のアミノ酸配列を、Ｎ末端側から順に含む１４２個～１７０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドに関する。さらに、該ポリペプチドにより表面を被覆した支持担体を用いた多能性幹細胞の培養方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を製造する方法に関し、(i)多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔ－３ａを含む培地中で胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程、(ii)工程(i)で得られた細胞を、先にシクロパミン、並びに、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－７、及びＦＧＦ－１０からなる群から選択される少なくとも１種類のＦＧＦを含む培地中で培養した後、前記細胞をシクロパミン、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－７、及びＦＧＦ－１０からなる群から選択される少なくとも１種類のＦＧＦ、並びに、ネトリンを含む培地中で培養することにより、膵臓内胚葉細胞に特徴的なマーカー（該マーカーの少なくとも１つは、ＮＧＮ－３、ニューロＤ、Ｉｓｌｅｔ－１、ＰＤＸ－１、ＰＡＸ－４、及びＮＫＸ２．２からなる群から選択される）を発現する細胞に分化させる工程、(iii)工程(ii)で得られた細胞を、エキセンジン－４及びＤＡＰＴを含む培地中で培養して、膵臓内分泌細胞に特徴的なホルモンを発現する細胞に分化させる工程を含む。

本発明は、以下の(a)ステップの後(b)及び(c)ステップを順次繰り返すことを特徴とする未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法に関する；(a)アニマルプロダクトフリーな基礎培地に、アクチビン、及び、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、オレイン酸からなるサプリメントを添加した多能性幹細胞用培地である第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ、(b)前記第一の培地を、アニマルプロダクトフリーな基礎培地に、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、オレイン酸からなるサプリメントを添加し、かつアクチビンを含まない多能性幹細胞用培地である第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ、および(c)前記第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ。

本発明は、ヒト多能性幹細胞から肝前駆細胞を製造する方法に関し、分化用培地中で基質に接着して単層培養される前記ヒト多能性幹細胞に分化誘導用転写因子の組合せとして、ＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαの組合せを発現させるステップを含むことを特徴とする。

本発明は、胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞から腸構造体を作製する方法に関し、(i) 基材、基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域（基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化及び／又は分解されて形成されたもの）、及び各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域（ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成されたもの）を備える細胞培養基材を準備する工程、(ii) 胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞を細胞培養基材に対し播種する工程、ならびに(iii)播種した胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞を培地中で培養する工程を含む。

本発明は、ヒト心筋細胞（ヒトiPS細胞由来の場合を含む）とヒト心臓線維芽細胞（ヒトiPS細胞由来の場合を含む）とヒト血管内皮細胞とを混合し凝集させたヒト心臓型スフェロイド、該スフェロイドにさらにヒト羊膜由来間葉系幹細胞を融合させたヒト心臓型融合体、  ならびに該スフェロイド又は該融合体を積層する（針状体に突き刺すことにより行われる場合を含む）ことを特徴とする心臓様三次元構造体の製造方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞からの色素幹細胞の製造方法に関し、以下の工程を含む；(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程、(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程、および(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程。好ましい形態として、 工程(b)が、多能性幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニスト、SCF、ET-3、cAMP誘導剤及びbFGFを含有する培地中で培養することにより行われる場合を含む。

本発明は、造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法に関し、該方法は、(i)ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞の集団において造血分化を誘導する工程、(ii)上記集団を、ＣＤ４３、ならびにＣＤ３４、ＣＤ３１およびＣＤ１４４のうちの少なくとも１つの発現に基づいて選別する工程、ならびに(iii)ＣＤ３４＋ＣＤ４３－、ＣＤ３１＋ＣＤ４３－およびＣＤ１４４＋ＣＤ４３－のうちの少なくとも１つである画分を選択する工程を含む。

本発明は、T細胞またはCDD34+造血始原細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法に関する。

本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための方法に関する。態様のひとつとして、ROCK阻害剤の存在下で、大体積の懸濁培養物中の多能性幹細胞を分化させることを含む。

本発明は、以下の工程（ａ）～（ｄ）を特徴とする心筋細胞の製造方法に関する；（ａ）多能性幹細胞に対して中胚葉細胞への分化誘導処理を行う工程、（ｂ）工程（ａ）で分化誘導処理した多能性幹細胞の中から心血管前駆細胞を分離する工程、（ｃ）工程（ｂ）で分離した心血管前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む培養液中で培養する工程、および（ｄ）工程（ｃ）で培養した細胞を培養液中で培養し、心筋細胞を調製する工程。

本発明は、多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離して凍結し、解凍後、細胞集塊を形成させることを特徴とする、多能性幹細胞の細胞集塊製造方法、凍結保存方法、ならびに凍結保存システムに関する。本手法により多能性幹細胞の凍結解凍の効率的な機械化および大規模処理が可能となる。

本発明は、多能性幹細胞から網膜色素上皮（RPE）細胞を生成するための方法に関し、以下の工程を含む；(a) 5%未満の動物由来タンパク質を含有する培地においてヒト多能性幹細胞を7-14日間培養して胚様体を形成する工程、(b)5%未満の動物由来タンパク質を含有する培地において前記胚様体を付着培養し、14-28日以内にRPE細胞を生じさせる工程、（c)工程（ｂ）の培養物からRPE細胞を選択する工程、(d)工程（ｃ）で選択されたRPE細胞を、EGF、bFGF、VEGF、および組換え型インスリン様成長因子のうち１つ以上を含む培地で培養する工程、および(e)工程（ｄ）のRPE細胞の成熟を促進しRPE細胞を含む培養物を生成する工程。

本発明は、表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質または該タンパク質を含む融合タンパク質を固定した後、ラクトースまたはガラクトースである糖側鎖を有するポリマーを固定した細胞培養基材に関し、前記タンパク質が、(1)E-カドヘリン、(2)E-カドヘリンと相同性を有しEC1、2、3、4、および5ドメインのうち１つ以上を含みE-カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質、または（３）E-カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上であり、かつＥ－カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質であることを特徴とする。さらに、該細胞培養基材と液体培地とを用いた多能性幹細胞の培養方法、あるいは多能性幹細胞の分化誘導方法に関する。