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本発明は、ヒト多能性幹細胞を角膜線維芽細胞馴化培地において細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養することを含む、ヒト角膜上皮細胞集団の作製方法に関し、前記角膜線維芽細胞馴化培地は、角膜を分散化剤と共にインキュベーションし、単離された角膜線維芽細胞を抽出し成長培地中で増殖させ、角膜線維芽細胞の細胞集団が約80-100%の密度に到達したときにマイトマイシンによって細胞の増殖を停止したのちインスリン、ヒドロコルチゾンおよびEGFを含む成長培地でインキュベーションし、単層物を形成する角膜線維芽細胞の培養物から前記成長培地を回収することにより調製されることを特徴とする。