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本発明は、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法に関し、以下の（a）ステップの後、（b）及び（c）を順次繰り返すことを特徴とする；（a）アクチビン、並びにフィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、セレン、及びＦＧＦ－２からなる群より選ばれるサプリメントを含む多能性幹細胞用培地（但し、ノックアウト血清リプレースメント及び／又はラミニン１１１を含むものを除く）である第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（b）前記第一の培地を、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、セレン、及びＦＧＦ－２からなる群より選ばれるサプリメントを含み、かつアクチビンを含まない多能性幹細胞用培地（但し、ノックアウト血清リプレースメント及び／又はラミニン１１１ を含むものを除く）である第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ； （c）前記第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ。