特許ポートフォリオ

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本発明は、次世代シーケンサーを用いて少数細胞または単一細胞レベルでmRNA定量解析を行うのに用いるcDNA集団を調製するための核酸配列増幅方法に関する。具体的には、該方法は、(a)任意の付加核酸配列X、ポリT配列、生物学的試料から単離したmRNA配列、ポリA配列および任意の付加核酸配列Yの順で構成される２重鎖DNAを鋳型とし、５'末端にアミンを付加した任意の付加核酸配列X（およびポリT配列）からなる第１のプライマーと、任意の付加核酸配列Y（およびポリT配列）からなる第２のプライマーとを用いて、該核酸配列およびポリT配列を増幅する工程、(b)工程(a)で得られた２重鎖DNAを断片化する工程、( c)工程(b)で得られた断片化２重鎖ＤＮＡの５'末端をリン酸化する工程、(d)工程( c)で得られた５'末端リン酸化２重鎖ＤＮＡを鋳型として、任意の付加核酸配列Zおよび前記付加核酸配列Y（およびポリT配列）からなる第３のプライマーを用いてcDNAを調製し、その３'末端へアデニン(A)を付加する工程、(e)工程(d)により得られた２重鎖DNAへ、３'末端にチミン(T)をオーバーハングで有する任意の配列Ｖを含む２重鎖ＤＮＡを連結させる工程、および(f)工程(e)により得られた２重鎖DNAを鋳型として、前記配列Ｖを含む第４のプライマーと、前記付加核酸配列Z（および前記の付加核酸配列Y）を含む第５のプライマーとを用いて、該２重鎖ＤＮＡを増幅する工程を含む。

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