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本発明は、以下の(a)ステップの後(b)及び(c)ステップを順次繰り返すことを特徴とする未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法に関する；(a)アニマルプロダクトフリーな基礎培地に、アクチビン、及び、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、オレイン酸からなるサプリメントを添加した多能性幹細胞用培地である第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ、(b)前記第一の培地を、アニマルプロダクトフリーな基礎培地に、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、オレイン酸からなるサプリメントを添加し、かつアクチビンを含まない多能性幹細胞用培地である第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ、および(c)前記第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ。